质谱解析-用高分辨质谱确定分子式

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理解高分辨质谱确定分子式，首先要破除一个常见但深刻的误解：高分辨质谱并非仅仅是“看得更清楚”的质谱。低分辨质谱仪，比如常见的单位质量分辨率的四极杆质谱，只能告诉我们一个离子最接近的整数质量。例如，它会测得一个质荷比为58的峰。然而，质量58的整数质量数可以对应无数种元素组合，如C₃H₆O、C₂H₆N₂、C₄H₁₀等，这些我们称之为“标称质量”相同的“同分异量素”。低分辨质谱对此束手无策，只能通过配合碎片信息、化学反应或同位素丰度进行推测，且往往无法得到唯一确定答案。高分辨质谱仪，例如飞行时间质谱、轨道阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱，其关键突破在于能以极高的精度（通常可达百万分之一级别，即<1 ppm）测量离子的“精确质量”。每种元素，其原子核的“质量亏损”不同，具体来说，碳原子（¹²C）的标准原子质量被定义为12.000000，但氢原子（¹H）是1.007825，氧原子（¹⁶O）是15.994915，氮原子（¹⁴N）是14.003074。这些非整数的精确值意味着，即便对于标称质量相同的不同分子式，其精确质量值也存在微小但可测量的差异。比如，同样是标称质量58.0，C₃H₆O的精确分子量为58.041865，C₂H₆N₂的为58.053098，而C₄H₁₀的则为58.078250。这些看似微小的差异（有时不到0.03个质量单位），是高分辨质谱仪完全可以精准测量的。

实际的操作流程通常是这样的：首先，通过软电离技术（如电喷雾电离）获得未知化合物的准分子离子峰，例如[M+H]⁺。然后，高分辨质谱仪测量这个峰在质谱图中的精确质荷比。获取到这个数值后，通常输入专用的软件中。分析人员需要指定预期存在的元素范围（如C、H、N、O、S、P等），软件便会基于已知的每种元素同位素的精确质量及其天然丰度，计算出所有可能的元素组合。理论上，可能有多个组合的计算精确质量都与测量值在误差范围内匹配。此时，判定唯一分子式还需要两个强大的“帮手”：一是高分辨率数据中的同位素丰度模式。一个含氯的分子，其[M+2]峰会非常显著；一个含有多个碳的分子，其[M+1]峰的强度比例会直接反映碳原子的数量。软件会将实验测得的同位素峰（主峰、M+1、M+2等）的相对丰度与每个候选分子式的理论丰度进行比对，通过统计拟合（如计算差异最小的最小二乘法），剔除那些匹配度差的选项。二是“元素组成合理性”的化学规则。分子式必须符合化学常识，例如，对于仅含C、H、N、O的有机化合物，其氢原子数不能超过一个基于碳、氮原子数计算出的上限（不饱和度规则），同时氮规则也提供约束。最终，软件通过质量精度、同位素丰度匹配度和化学规则三者联用，会给出一个或几个可能性极高的候选分子式，通常误差小于5ppm时会首选排名第一的选项。
让我们通过一个具体的案例来感受这个过程。在研究一种从植物中提取的天然产物时，我们通过LC-MS得到其ESI正离子模式的谱图，观察到一个强的准分子离子峰。低分辨模式下，该峰的四舍五入质荷比为291.2，初步推测其分子量可能为290。我们将样品送入一台高分辨飞行时间质谱仪，测得该[M+H]⁺离子的精确质荷比为291.1234。我们将测量值连同合理的元素范围（C: 0-30， H: 0-60， O: 0-10）输入软件，同时将仪器测量精度设为5 ppm。软件列出了几个可能的分子式，排名前两位的分别是C₁₈H₁₈O₃（计算精确质量291.1230，误差 -1.4 ppm）和C₁₅H₂₂N₆O（计算精确质量291.1228，误差 -2.1 ppm）。两者误差相近，难以仅凭质量判断。接着，软件调取了该质谱峰周围的同位素峰数据，实验测得的[M+1]峰（m/z 292.1268）的相对丰度为[M+H]⁺峰的18.9%。计算可知，对于C₁₈H₁₈O₃，其理论[M+1]丰度（主要来自¹³C贡献）应为19.7%；而对于C₁₅H₂₂N₆O，其理论值为16.9%。实验值明显与前者更为接近。结合该产物已知的植物来源和分离极性（更可能是一个含氧的三萜类似物而非含氮生物碱），我们便可以高度自信地确定该未知物的分子式为C₁₈H₁₈O₃。这个分子式一旦被确定，就成为后续所有结构解析，包括核磁共振、质谱-质谱碎裂分析以及最终合成验证的绝对基石。没有这个精确的“化学式地图”，后续的结构探险将迷失在无数可能性之中。