高分辨率质谱技术解析抗体药物偶联物（ADC）生物转化路径 —— AZD8205 结构稳定性再

搁浅

高分辨率质谱技术解析抗体药物偶联物（ADC）生物转化路径 —— AZD8205 结构稳定性再获实证（DOI: 10.1021/acsptsci.4c00445）

随着肿瘤精准治疗理念的不断深入，抗体药物偶联物（ADC）凭借“靶向+化疗”双重机制成为当下最具潜力的抗癌 modality 之一。然而，ADC 进入体内后是否稳定、是否会意外释放毒性载荷（payload）、又会产生哪些未知代谢产物，直接决定了其疗效与安全性边界。近日，ACS Pharmacology & Translational Science 在线发表了阿斯利康团队的一项方法学研究，利用高分辨率多重反应监测（LC-MRMHR）结合碰撞诱导解离（CID）与电子激活解离（EAD）两大互补碎裂技术，首次从肽段水平系统描绘了抗 B7H4 拓扑异构酶抑制剂 ADC——AZD8205（puxitatug samrotecan）在人及小鼠血浆中的生物转化全景，为阐释该药物优异的体内稳定性提供了坚实的结构证据。

一、从“自上而下”到“自下而上”：灵敏度与分辨率的双重升级
此前，该团队已通过“亲和捕获-完整蛋白 LC-HRMS”策略发现 AZD8205 主要经历琥珀酰亚胺水解反应，仅极少比例发生载荷脱落。然而，完整蛋白方法受限于离子抑制与谱图重叠，对痕量代谢产物（<3%）的精细结构解析力不从心。新研究转而从“自下而上”视角出发：借助抗独特型抗体磁珠富集 ADC 后，在磁珠表面直接进行 70 °C 快速胰酶酶切，避免还原剂干扰潜在二硫键；随后利用 74 min 超梯度将酶切肽段分离，并在 SCIEX ZenoTOF 7600 上开展高分辨率 MRMHR 扫描——CID 提供常规 b/y 离子序列，EAD 则优先切断二硫键并保留侧链修饰信息，实现“一套样品、两套碎裂、交叉验证”。

二、三大发现：水解异构体、载荷脱落-巯基加合物与二硫键重构

• 琥珀酰亚胺水解的“位点偏好”与“异构体比例”
  AZD8205 通过还原四对链间二硫键后在轻链 Cys、重链 Cys 及铰链区 Cys 共 8 个位点偶联载荷。酶切后产生 GEC（轻链）、SCDK（重链）与 THT（铰链）三条特征肽段。实验显示，72 h 后 >95% 的琥珀酰亚胺已发生开环水解；其中 SCDK 肽段生成的 thio-isoAsp 与 thio-Asp 比例约 3:1，而 GEC 肽段几乎 1:1，提示局部微环境可显著影响水解立体选择性。EAD 产生的诊断离子无需对照品即可准确区分两种 constitutional isomer，解决了传统 CID 无法定位甲基化或异构化的痛点。
• 载荷脱落后的“巯基加合物谱”
  极少量未水解的琥珀酰亚胺可经 Retro-Michael 反应丢失载荷，暴露出的游离巯基与血浆中丰富含硫醇小分子再氧化形成混合二硫键。研究共鉴定到 Cys、GSH、同型半胱氨酸及 Cys-Gly 四种加合物，其中 Cys 加合物在重链铰链区 C4 位点显著富集（约占 70%），而 GSH 加合物在 C4/C7 两位点分布接近。该结果不仅解释了早期完整蛋白实验中“神秘+119 Da”信号的来源，也提示未来若采用反义寡核苷酸或 RNAi 下调血浆游离 Cys 浓度，有望进一步降低载荷非特异脱落风险。
• 链间/链内二硫键“再闭合”
  最意外的发现是“零二硫键”设计的 AZD8205 在长时间孵育后竟出现轻链-重链（Lc+Hc）及重链-重链（Hc+Hc）重新桥接的产物，占比分别为 2.5% 及 <0.5%。EAD 选择性切断 S-S 键产生的 z+ 离子直接证实了新二硫键的存在；而 CID 的高序列覆盖率则精确定位了连接位点。该现象提示：载荷脱落后若局部空间距离合适，游离 Cys 可“自发”寻找伴侣重新氧化，或成为未来 ADC 结构设计的新变量——既可能增加热稳定性，也可能引发免疫原性，需要结合体内 PK/PD 综合评估。
  

三、方法学意义：让“低丰度”代谢事件不再被忽略
文章比较了同一批样品用完整蛋白 LBA-LC-HRMS 与 LBA-LC-MRMHR 两套平台的检测限：前者对 Lc+Hc 二硫重排产物的 LOQ 约为 2%，后者借助高分辨率 MRMHR 可将 LOQ 降至 0.1% 以下，且能同时给出位点-特异结构信息。作者指出，该流程完全兼容 96 孔自动化磁珠操作，可与临床前/临床样品常规 PK 测定共用同一份亲和捕获步骤，实现“一管样品，多重终点”。

四、展望：ADC 生物转化研究进入“软件预测+实验验证”闭环时代
随着 AI 驱动的代谢产物预测算法日趋成熟，未来仅需输入 ADC 氨基酸序列、偶联位点与载荷结构，即可在硅体内枚举数百种潜在转化路径。本研究建立的高灵敏度 LC-MRMHR 实验框架，可作为“验证端”快速筛选并量化低丰度产物，形成“预测-实验-修正”闭环。作者团队已将该方法拓展至多个不同 linker-payload 平台的 ADC，并开发高通量自动积分脚本，可在 2 h 内完成 96 个样品的靶向分析，为早期 DMPK 筛选及后期监管申报提供扎实数据。

结语
AZD8205 的案例再次证明：ADC 的体内命运并非仅由“DAR”或“linker 稳定性”一句话概括，不同偶联位点、局部微环境乃至血浆代谢背景都会共同塑造其生物转化谱。高分辨率质谱与多维度碎裂技术的联姻，让科学家得以“像素级”审视每一种偶联变体，为下一代更安全、更高效的 ADC 设计指明方向。