共振X射线衍射测定金属氧化态

casjxm

原理：
        有些时候，我们很有必要知道一个化合物、蛋白质或生物酶等物质中金属离子的氧化态（价态），这对于理解化学反应中电子转移过程的机理是非常关键的。常规的谱写手段，如EPR和XPS能分辨元素的氧化态，但没有空间分辨能力，即如果材料中含有不同价态的同一元素的原子，不同位置的原子的价态是无法分辨的。

        虽然常规的X射线晶体学提供了基础的结构信息，但它对区分还原态和氧化态的一两个电子的细微差异也无能为力（电子结构晶体学可以，但对晶体样品质量要求非常高）。另一种对氧化态敏感的光谱方法是X射线吸收光谱（XAS）。尽管X射线吸收边的位置主要取决于元素种类和配位环境，但它也对氧化态敏感，因为氧化会导致吸收边向更高能量方向移动。这是因为氧化后，每个剩余的电子与未变化的核电荷之间的相互作用增强了。例如，在各种化合物中，二价铁（Fe²⁺）和三价铁（Fe³⁺）之间的吸收边位置可移动约+1至+5 eV。然而，由于光谱重叠，对于含有多个相同金属位点的复杂金属蛋白，通过XAS将氧化态归属到特定中心会存在困难。
        吸收效应会导致X射线原子散射因子 f(λ) 随波长变化，其表达式为：
f(λ) = f⁰ + Δf'(λ) + iΔf''(λ)
        其中 Δf'(λ) 和 Δf''(λ) 通过Kramers-Kronig变换相关联，它们分别代表在无吸收效应时观测到的散射因子 f⁰ 的实部（色散）和虚部（吸收）修正量。这些波长依赖的效应通常被称为“反常散射”。
        在大分子晶体学中，散射因子的波长依赖性常被用于识别亚结构以解决相位问题并计算电子密度图。吸收边的详细结构和位置所包含的信息通常未被利用。然而，如果在吸收边附近适当间隔的能量点收集多个数据集，就有可能针对特定元素的各个散射体精修其Δf'和Δf''的值，从而推导出每个独立原子的X射线吸收曲线。这样，就能推断出各个原子的氧化态。

公式化及计算过程：
        复结构因子可以计算为晶体单胞内 m 个原子的各个原子散射因子 fm 的总和，并表达为一个振幅 |F| 和一个相角 R，或者由其实部 A 和虚部 B 表示：

        在给定波长下，n 个吸收（“重”）原子对总结构因子的贡献——突出了 Δf'(λ) 和 Δf''(λ) 变化的影响——可以形式上从蛋白质中非吸收原子的贡献中分离出来：

        由于相角 、每个原子散射因子实部和虚部可以利用已知结构的坐标计算得到，实验观察到的差异是关于 Δf'n(λ) 和 Δf''n(λ) 的线性函数，因此它们可以通过求解一系列观测方程的最小二乘解获得。该过程的结果是，收集数据的 X 射线能量点，获得每个反常散射体的 Δf'n(λ) 和 Δf''n(λ) 的单独值。
分析表明，虽然 Δf'n(λ) 值的相对大小相当依赖于参考数据集的选择，并且对精修结构的占位度和温度因子敏感，但 Δf''n(λ) 的值则非常稳健。该方法应普遍适用于在吸收边处收集的 X 射线数据，并且与诸如衍射反常精细结构等方法相比，它能直接应用于大分子量金属蛋白的晶体。

实例：
        为了测试该方法的可行性，以含有 [2Fe-2S] 簇的铁氧还蛋白 Fd4进行了测量。该簇中的铁原子呈反铁磁耦合，在氧化态 (Fe(III)/Fe(III)) 下自旋态为 S = 0，在还原态 (Fe(II)/Fe(III)) 下自旋态为 S = 1/2，其中还原态下的额外电子局域于其中一个金属中心。在铁 K 吸收边附近选取了九个能量点，并收集了完整的衍射数据集。根据 X 射线荧光扫描图，选择的能量包括低能和高能参考点（7100 和 7140 eV）以及吸收边附近的七个数据集（7114、7116、7118、7120、7122、7124 和 7126 eV）。使用一个在 7140 eV 收集的数据精修至 1.8 Å 分辨率的 Fd4 模型，来计算轻原子（C、N 和 O）、所有硫原子、来自结晶缓冲液的两个镉离子以及不对称单元内四个独立铁原子各自的结构因子的实部 和虚部 。硫和镉显示出明显的反常散射贡献，但没有吸收边特征，可作为一个有用的内标。

        文献作者编写了一个计算机程序，用于读取精修后的蛋白质结构坐标和预标度的反射数据，以计算结构因子并求解线性最小二乘问题。得到的精修后的 Δf′′ 值显示出异常信号的增强，这与先前进行的荧光扫描结果高度吻合，而硫和镉的贡献则保持稳定（图2）。晶体不对称单元中两个蛋白质单体内的等效铁原子给出了几乎相同的结果，而同一簇内的两个铁原子则显示出显著差异（图2）。更靠近表面的铁原子（Fe2 和 Fe4）的 Δf′′ 值变化过程明显向更低能量方向偏移，表明其处于还原态的 Fe(II) 状态，而更深入埋藏在蛋白质内部的铁原子（Fe1 和 Fe3）则显示出在更高能量处的吸收边，并被推测处于氧化态的 Fe(III) 状态。靠近表面的铁原子是接受和释放电子的那个，这一发现与之前的推论一致
。我们进一步注意到，Fe(III) 离子似乎甚至反映了仅在氧化态才出现的 7114 eV 处的 XAS 前边特征。

        金属簇中氧化态的指认有望成为一种稳健而通用的工具，用于研究这些基团的电子结构。尽管仍需针对一些问题进行进一步优化（例如所需的最小分辨率和数据量、氧化样品中的光还原效应等），但该方法应普遍适用于复杂的金属蛋白，如固氮酶、一氧化碳脱氢酶或多血红素 c 细胞色素。从单个金属的吸收边位置和形状中获得的信息将为氧化态提供实验评估，并应能用于指导和验证理论计算。

引用：
1.        Einsle, O., Andrade, S. L. A., Dobbek, H., Meyer, J. & Rees, D. C. (2007). J. Am. Chem. Soc. 129, 2210–2211.
2.        Frank Lennartz, Jae-Hun Jeoung, Stefan Ruenger, Holger Dobbek and Manfred S. Weiss, Acta Cryst. (2022). D78, 238–247