疏水作用色谱的原理及应用

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疏水作用色谱是一种专门用于分离蛋白质等生物大分子的液相色谱技术，其核心原理是利用生物分子表面疏水微区与固定相上适度疏水配基之间的可逆相互作用，并通过调控流动相中盐的浓度来实现分离。这种方法与反相色谱有相似之处，但关键区别在于其固定相的疏水性要弱得多，通常仅为反相色谱固定相的几十分之一到几百分之一，并且流动相全程使用含盐水溶液，避免了有机溶剂的使用，从而为保持蛋白质等生物大分子的天然构象和生物活性提供了极为温和的分离环境。

其分离机理可以从热力学和分子行为两个层面来理解。在热力学上，当疏水性溶质分子分散在水中时，会迫使水分子在其周围形成有序的“空穴”结构，这个过程导致系统的熵减小，在热力学上是不利的。当这些疏水分子相互靠近或与疏水固定相结合时，它们减少的疏水表面积会使一部分有序排列的水分子被释放回自由状态，从而增加系统的熵，使得整个结合过程在热力学上自发进行。从实际操作角度看，分离过程依赖于“盐析”效应。在高离子强度的盐溶液（如1-4 mol/L的硫酸铵或氯化钠溶液）中，大量的盐离子会与水分子强烈结合，导致可用于包裹蛋白质疏水区域的水分子减少，这促使蛋白质分子表面的疏水基团（或称“疏水补丁”）暴露出来，并与固定相上的疏水配基（如丁基、苯基、辛基等）发生可逆的吸附结合。此时，不同蛋白质因其表面疏水微区的数量、分布和疏水性强弱不同，与固定相的吸附力也存在差异。洗脱时，通过逐步降低流动相的盐浓度（即进行从高盐到低盐的梯度洗脱），洗脱能力逐渐增强。吸附力最弱、疏水性最小的蛋白质会首先从固定相上解吸附而被洗脱出来；随着盐浓度进一步降低，吸附力更强、疏水性更大的蛋白质依次被洗脱。最终，蛋白质按照其疏水性从小到大的顺序流出色谱柱，实现分离。对于某些疏水性极强的物质，有时需要在低盐流动相中添加少量有机溶剂以辅助解吸附，但需谨慎操作以防目标蛋白变性。

疏水作用色谱在生物技术，尤其是生物制药领域具有不可替代的重要应用，其主要优势在于能够高分辨率地分离复杂样品，同时保持目标蛋白的高回收率和生物活性。一个典型的应用案例是单克隆抗体的纯化。在抗体生产工艺中，细胞培养上清或腹水经过初步处理后，常含有大量宿主细胞蛋白、核酸、内**等杂质。由于抗体分子表面具有特定的疏水区域，可以利用疏水作用色谱进行精细纯化。例如，将含有单抗的样品在高盐条件下上样至苯基或丁基疏水色谱柱，大部分亲水性杂质不保留直接流穿，而抗体则被吸附。通过逐步降低盐浓度的梯度洗脱，可以将抗体与疏水性不同的杂质蛋白有效分离，获得高纯度的产品，且抗体活性得到完好保持。另一个重要应用是分析蛋白质的构象变化。蛋白质的构象异构体可能具有不同的表面疏水性。例如，用甲胺处理过的α2-巨球蛋白会发生构象变化，其“快”型（非活性）和“慢”型（活性）构象异构体在非变性电泳中迁移率不同，而通过疏水作用色谱可以更清晰地将这两种构象体分离开，为研究蛋白质结构与功能关系提供了有力工具。此外，该技术也广泛应用于重组蛋白（如HIV反转录酶）、血清蛋白、膜蛋白、**白、受体以及疫苗等生物制剂的分离纯化，并且常与离子交换色谱、凝胶过滤色谱等技术联用，构成多步纯化策略，以应对极其复杂的生物样品分离挑战