电子衍射专题2——借助电子衍射仪XtaLAB Synergy-ED 打破 1 微米晶体结构解析技术桎梏

轻舞飞扬

Rigaku Journal, 38(1), 2022，Pages02-06；技术文章
作者：伊藤翔*和山野明仁**，
摘要

       三维电子衍射(3D ED)/微电子衍射（MicroED）是一种可以从亚微米级晶体中获得三维分子结构的技术。然而， 3D ED/ 微型ED需要电子显微镜和晶体学方面的专业知识。在这里，我们介绍了新开发的用于3D ED/MicroED实验的电子衍射仪XtaLABSynergy-ED，其仪器配置，测量流程和测量实例。

XtaLAB Synergy-ED的配置

       历史上，3D ED/微ED是用高分辨率冷冻电子显微镜进行的，主要用于通过单颗粒分析确定蛋白质结构。然而，高分辨率冷冻电子显微镜在转换衍射模式进行3D ED/微ED实验时，需要对透镜条件等因素进行大量调整，只有熟悉电子显微镜的专家才能使用。为了使非专家能够轻松地进行3D ED/微ED实验，XtaLAB Synergy-ED设计了以下配置(1)（参见图1）； XtaLAB Synergy-ED致力于电子衍射;因此，获取高分辨率透射电子显微镜（以 下简称“TEM”）图像的能力是不必要的，并且大 约10,000倍的放大倍率（即能够观察到几nm的晶体） 足以在载网上搜索晶体。衍射实验需要平行光束， 并且在成像模式和衍射模式之间切换时，透镜值的变化极小。为了实现这一目标，通过将会聚小透镜从透镜系统中剔除，并用弱物镜代替强物镜，对电子光学进行了优化。这些变化提高了入射光束的平行度，并使在成像模式和衍射模式之间切换时透镜值的变化最小化。

这允许我们通过点击集成软件包CrysAlisPro ED中的一个按钮来切换模式。这种透镜系统的简化还允许XtaLAB Synergy-ED在成像系统中使用固定的中间镜设置，这大大减少了操作人员的工作量，例如手动调整每个透镜值和选择适当的光阑。最后，一个电子衍射探测器， HyPix-ED，也被开发并纳入XtaLAB Synergy-ED。HyPix-ED是在用于X射线衍射的HyPix探测器的基础上开发的直接检测探测器。这种耐用的探测器可以抵抗入射束，并且不需要挡针。此外，HyPix-ED能够检测单个电子，从而实现高质量的测量。

图1所示。XtaLAB Synergy-ED电子衍射仪，专为3D ED/微ED实验设计(a)XtaLAB Synergy-ED透镜系统的整体视图。虽然在此图中进行了简化，但安装了三个聚光透镜和两个物镜，如图(b)所示。(b)XtaLAB Synergy-ED与标准TEM之间透镜系统的差异

实验部分：从样品制备到结构测定

      我们已经开发了许多X射线衍射仪，最新的旗舰型号， XtaLAB Synergy Custom配备了一个FR-X发生器，可以测量小到大约一微米大小的晶体。然而，小于1 μm的晶体很难用X射线测量，我们称之为“1 μm壁垒”。为了克服这一点，XtaLAB Synergy-ED被用于纳米晶体的晶体结构分析。测量过程可以简单描述如下（见图2）：1。将化合 物的细颗粒铺在载网上。当平均晶体尺寸大于1  μm 时，使用一对显微镜玻片对样品进行粉碎，以减小 颗粒尺寸。晶体的厚度——这里指的是沿着光束方向测量的尺寸——比它的其他尺寸更重要。即使晶 体本身尺寸很大，只要它的厚度小于1  μm就可以测量出来。需要注意的是，最佳的样品厚度取决于化 合物的类型和电子束的加速电压；对于有机分子， 小于1 μm，对于有机金属配合物，小于500 nm，对于无机材料，小于100 nm， 200 kV电子束。然而， 如果样品厚度小于1μm，几乎任何样品都可以进行评估。2. 将载网安装到XtaLAB Synergy-ED中。3. 在成像模式下定位晶体并找到中心位置（X射线晶体学 家称之为“对心”的步骤）。4. 用电子束照射晶体， 测量衍射强度(2) 。重要的是，一旦将样品加载到XtaLAB Synergy-ED中，CrysAlisPro ED将执行所有操作：仪器控制，成像和衍射模式之间的切换， 数据处理和自动结构分析。CrysAlisPro ED也可以在离线模式下进行更详细的数据处理，然后用Olex2和SHELX进行分析(3)-(5)。

图2所示。从样品制备到结构确定的测量流程(a)。高结晶样品可以直接撒在到载网上。所需的样品量通常小于1毫克。只需将网格  放在放置在显微镜玻片上的晶体上，晶体就会分散在网格上。仪器控制、数据采集和数据还原均由CrysAlisPro ED完成。定相和精修采用X射线晶体学的常规方法进行。(b)对结晶度差的样品进行载网上再结晶的示意图。这一过程有时会提高结晶度。将化合物溶解在某种溶剂中，将几微升溶液加载到载网上，然后将溶液干燥。

XtaLAB Synergy-ED测定晶体结构

      作者在理学应用实验室使用XtaLAB Synergy-ED分析了潜在客户送来的各种样品，目前已经成功确定 了100多种化合物的结构。这些化合物的统计数据如图3所示，展示了样品类型的多样性和典型的分析质量。

       对于迄今为止已确定结构的化合物，数据集的完整度几乎都大于70%。此值可视为成功确定结构的阈值。图3还显示了完整度低于70%的化合物。这些都是测量过程中引入的杂质的结构。至于化合物的类型，有机化合物占总数的60%以上，但这种偏差可能是由于我们测量的是潜在用户要求的化合物。不过，我们也测量了金属有机化合物和无机化合物。

       属于高度对称晶体系统的晶体，如立方晶体，由于其高衍射对称性，需要更窄的倾转范围，因此更 容易测量，而属于三斜或单斜系统的晶体则更困难，因为它们需要更宽的倾转范围才能获得足够的完整度。然而，使用XtaLAB Synergy-ED，单斜晶系1-2 个晶体和三斜晶系1-3个晶体可以达到70%或更高的完整度，可以将平台倾斜±90°。CrysAlisPro ED通过轻松合并从多个晶体获得的数据集，帮助实现高完整度。精修后R1的均值和中位数均为16.41%。这些值比X射线得到的值要高，因为在电子衍射中多重散射的影响要大得多。尽管如此，作者认为这些值比预期的要好得多，因为这些分析是通过动态精修进行的，而动态精修并没有考虑多重散射效应。

      我们还将已经沉积在CSD中的电子衍射实验的CIFs 值R1 值（ 平均值21.70% ， 中值18.91% ）与XtaLAB Synergy-ED 测定的CIFs 值R1 值进行了比较，发现XtaLAB Synergy-ED的R1值更好。

图3所示。截至2021年12月20th日，使用XtaLAB Synergy-ED确定了102种化合物的结构统计数据。

(a)     图中显示了完整度、(b)化合物类型、(c)晶体体系和(d) R1值。*所有完整度低于70%的化合物都不是目标化合物，而是杂质。

XtaLAB Synergy-ED的应用案例

      XtaLAB Synergy-ED不仅可以用于纳米晶体的结构测定，还可以用于各种其他应用。这里给出两个例子：杂质鉴定和多态性检测。这些样品的晶体尺寸约为100-500 nm，难以用单晶X射线衍射解析。当某商品药品的内容物除去胶囊并测量其晶体数量，鉴定出一种杂质硫酸钠（图4）。这种杂质没有列在药物的成分表中，但十二烷基硫酸钠列在了成分表中。由于这两种化合物都有一个磺基，而且十二烷基硫酸钠可以被降解， 所以这种硫酸钠有可能是十二烷基硫酸钠的降解产物，而十二烷基硫酸钠在药品中被用作添加剂。因此，可以看出，XtaLAB Synergy-ED可以有助于鉴定样品中存在的少量成分。

图4所示。杂质鉴定。同质多晶检测也可以用类似的方法进行

      对于同质多晶检测，使用氧化钛作为测试样品。这种化合物已知有两种主要的多晶相，金红石和锐钛矿。XtaLAB Synergy-ED很容易识别样品中的两个相（图5）。重要的是，在此测量中使用的样品量远少于1 mg，晶体的测量时间约为1 分钟，表明XtaLABSynergy-ED可用于只能少量制备的样品的快速测量。由于同质多晶对化合物的物理性质有重要影响，因此使用XtaLAB Synergy-ED对多晶相进行简单快速的检测有望在各个领域得到应用。

图5所示。氧化钛中同质多晶检测。在CrysAlisPro ED中Ewald浏览器显示的a轴投影的倒易空间。根据晶胞的值，鉴定出多晶型(a)锐钛矿和(b)金红石。

结论与未来设想

       在本应用研究中，介绍了XtaLAB Synergy-ED的配置、已经测定结构的统计数据以及使用XtaLAB Synergy-ED的应用示例。由于可用的晶体尺寸小，许多重要化合物的许多晶体结构尚未通过X射线衍射确定。XtaLAB Synergy-ED可以成为分析这类纳米晶体结构的有力工具。此外，XtaLAB Synergy-ED在制剂和材料开发领域的杂质和多晶物相鉴定可能会在未来变得更加流行。XtaLAB Synergy-ED正在进行进一步的改进，特别是自动化测量和各种数据处理功能，以及考虑多重散射的结构分析。在不久的将来，电子衍射将成为与X射线衍射互补的主要结构测定方法之一，而XtaLAB Synergy-ED将有助于许多结构测定。

参考文献

( 1 ) S.Ito, F. J. White, E. Okunishi, Y. Aoyama, A. Yamano, H. Sato,J. D. Ferrara, M. Jasnowski and M.Meyer: CrystEngComm, 23, (2021), 8622–8630.

( 2 ) W. Kabsch: Acta Crystallogr., Sect. B: Struct. Crystallogr.Cryst. Chem., 34, (1978), 1049–1050.

( 3 ) T. R. Schneiderand G. M Sheldrick: Acta Crystallogr.,Sect. D: Biol. Crystallogr., 58,(2002), 1772–1779.

( 4 ) G. M. Sheldrick: Acta Crystallogr., Sect. A: Found. Adv., 71(1),(2015), 3–8.

( 5 ) G. M. Sheldrick: Acta Crystallogr., Sect. C: Struct. Chem., 71, (2015), 3–8.

本文译自ShoIto and Akihito Yamano,Rigaku Journal, 38(1), 2022

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本想发在资源子版块文献分类，后来想想ED比较新的技术，还是发在讨论区供大家学习讨论比较好~

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