众所周知，生物分子会折叠成复杂的形状，并在溶液中呈现多种构象，这通常会受到结合伴侣或微小修饰的影响。因此，分析方法需要精确，对分子大小和形状都敏感，并且最好基于单分子观察。Zhu等人开发了一种基于微流控芯片的方法——逃逸时间立体测量法，可以实时分析溶液中分子的大小和构象（参见Goldsmith和Brewster的“观点”）。作者在测量小分子反应动力学、DNA和RNA纳米结构中的构象差异以及生物分子间结合的实验中证明了这种方法的有效性。——Michael A. Funk
一、研究背景
在追求更高分辨率的生物分子表征手段过程中，分析技术取得了显著进展。不过，当前主流的方法往往依赖于强电场或强光照，或者需要将分子固定、约束于某种表面，甚至借助基质材料辅助检测。问题是，这些操作都有可能影响分子本身的结构完整性和功能状态——毕竟生物分子的构象稳定性，主要来自于分子间与分子内多种弱相互作用的微妙协同。因此，科学界一直在寻找一种理想的技术，既能在溶液环境中维持分子的原始状态，又能实现高精度的结构与功能分析。这类方法的出现，将是分子生物学和生物物理领域中的一项关键突破。
二、关键问题
分子的大小与几何形貌是识别其种类及所处状态的重要参数。这项研究提出了一种依托微芯片平台的高通量成像策略，能够在接近天然溶液环境下，对分子特性进行快速而精确的分析。该技术具备广泛的分子质量适应能力，覆盖至少三个数量级，并能识别小分子间仅有两个碳原子差异的细微变化。文章量化了分子间在六个数量级范围内的亲和力变化，并实现了化学反应进程的实时动态监控。该方法可对单个分子进行大规模并行检测，以最高空间分辨率揭示样品内部状态的多样性，为三维结构预测建模提供关键依据。此外，借助其对构象变化的高度敏感性，本文还拓展了该技术在生物诊断方面的应用。例如，利用胰岛素受体与其配体结合引发的结构转变，实现在亚纳升体积与仄摩尔浓度水平下，对血清中胰岛素含量的灵敏检测。
三、结果讨论
溶液相逃逸时间立体测量 1.物体在流体中运动时产生的摩擦阻力，会清晰反映其体积与形状特征——体积越大的物体，在给定时间内平均移动距离越短。斯托克斯半径（rH）正是量化这一特性的参数，已被广泛用于表征溶液中的分子种类。对于固定体积的物体，其形状紧凑度可通过最小包络球直径（Ds）来表征，该参数与小角X射线散射（SAXS）中使用的分子最大空间延展度（Dmax）具有相似性（图1C）。事实上，尺寸排阻色谱等常用实验室技术正是利用这一分子特性来实现混合物的分离筛析。通过直接观测分子在特定环境中的运动来实现分子尺寸与形状的精确测量（即"分子立体测量术"），有望获得传统认知中仅能通过高分辨率技术获取的结构敏感性读数（图1A）。 2.实验中，研究者将浓度为10飞摩尔至10纳摩尔（溶于离子强度约160 mM的磷酸盐缓冲液PBS）的荧光分子注入高度为h1的平行板狭缝阵列中，该狭缝表面具有周期性圆柱形凹坑结构（总高度h2）（图1A、B）。与先前研究一致，这些"口袋"纳米结构可充当溶液中单分子的热力学陷阱（图1B）。不同的是，高盐浓度条件使电荷相关的静电效应可忽略不计，因此该陷阱可视为纯粹的熵效应主导。采用标准宽场显微技术，对平均标记单个荧光团的分子扩散动力学进行成像观测（图1A）。通过每种样品约1分钟的芯片成像，研究者们测量了从小分子有机荧光团到无序蛋白、球状蛋白、核酸及蛋白质复合物等多种分子的平均逃逸时间tesc（图1D、E和图2A）。标准成像条件为：曝光时间texp=5毫秒，采集频率100赫兹。针对低拷贝数计数实验及后续讨论的胰岛素受体实验，狭缝表面经聚乙二醇钝化处理以降低非特异性分子吸附。
逃逸时间与分子敏感性分析 1.通过对横跨三个数量级分子量范围的分子进行逃逸时间（tesc）测量，球状分子符合预期标度关系tesc∝ rH∝ M1/3——这意味着tesc测量误差<1%可转化为分子量<3%的测量误差（图2A）。而对于无序蛋白，其逃逸时间显著延长，符合非结构化聚合物特有的标度关系 tesc∝ rH∝ M3/5（图2A）。 2.在检测荧光染料ATTO532小分子衍生物（分子量M≲1 kDa）时，逃逸时间约0.5%的测量精度理论上可区分仅相差一个碳原子的分子（图2B）。实验成功分辨出ATTO532的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）与马来酰亚胺衍生物之间25 Da的分子量差异。值得注意的是，ATTO532-NHS酯（M=743 Da）在水中会水解生成羧基化ATTO532并释放NHS基团，该过程在碱性条件下显著加速。通过pH 7和pH 9条件下对ATTO532-NHS溶液进行持续流动监测（每次间歇测量30秒），记录所有逃逸事件持续时间Δt对应的平均逃逸时间tav（图2B右图）。约10分钟内观测到tav系统性降低3%，对应约100 Da的质量变化，与NHS离去基团的质量相符。pH 9条件下测得的衰减速率常数2.3×10-3s-1与文献报道的~5分钟半衰期高度吻合。这种实时追踪水解反应导致分子量变化的能力，充分体现了该方法在检测速度与精度上的双重优势。
分子三维构象对逃逸时间的影响 1.由于熵阱（ETs）能对分子形状进行高灵敏度可调控的区分——即使这些分子在其他相关参数（如流体力学半径、质量和电荷）上几乎完全相同，作者研究了具有相同碱基对数量但三维构象不同的DNA纳米结构。实验选用由240个碱基组成的DNA纳米结构，其构象分别为"束状"（bundle）和"方瓦状"（square-tile）（图3B），其中束状结构的特征尺寸Ds≈20 nm，可作为测量尺度的参考值。这两种结构在荧光相关光谱（FCS）扩散系数测量中无法区分。 2.研究者们在高度h1≈100、70和40 nm的狭缝中对两种结构进行了逃逸时间（tesc）测量（图3B）。当h1≥70 nm时，tesc对分子构象的相对不敏感性主要反映纯扩散主导的响应机制。但随着h1减小并接近Ds，两种DNA纳米结构的tesc差异系统性增大至1.2倍。这表明通过调节测量模式，可增强逃逸时间读数对分子三维构象（体现为Ds）的灵敏度。
构象谱与结构模型的对比 1.如下图1、2、3所示的群体水平逃逸时间数据分析可揭示多时间尺度特征（具体取决于样品特性）。这种多时间尺度分布通常蕴含重要样品信息，例如反映多聚体的异质化状态或单体分子中可区分的三维构象状态。虽然在特定条件下，从群体测量数据中提取这些时间组分及其丰度可能面临数学解析难题，但单分子水平的信息获取不仅能规避多指数拟合的潜在模糊性，更能深入揭示分子状态的本质特征——例如判断观测到的状态差异是源于具有稳定三维构象的单个分子，还是由不同构象态之间的快速互变所导致。 2.通过显微镜视场内每个单分子的跳跃动力学追踪，该工作功构建了反映混合体系中不同分子种类或状态的单分子逃逸时间谱（图4）。在低样品浓度（~10 pM）下进行测量时，可清晰识别源自单个分子的运动轨迹，此时平均逃逸时间（tav）直接表征单个分子状态的构象特性（图4A）。首先通过24-bp与60-bp DNA的等摩尔混合体系验证了该方法识别、区分和量化稳定单分子状态的能力（图4B）。通过记录每个单分子跳跃轨迹（包含Nhop次不同持续时间Δt的逃逸事件）的tav值，构建了单分子逃逸时间谱。当前技术条件下，单个分子在荧光标记光漂白或扩散出视场前，通常可记录Nhop=200-300次跳跃事件，这使得单分子tav测量精度达到1/√Nhop≈5-7%。
DNA杂交体系结合/解离及其亲和力测定 1.然后探究了该方法在快速定量分析混合物分子间相互作用方面的能力，包括解离常数（Kd）及结合/解离速率（kon和koff）的测定（图5）。DNA杂交体系因其可调控性成为理想模型——通过单碱基对增减即可显著改变互补链间的结合亲和力，这使得测量结果既能与独立实验技术对照，又可与理论预测比较。实验采用ATTO532标记的短链ssDNA（7-15个碱基）作为荧光"诱饵"，与约200碱基的未标记ssDNA支架5'端互补序列杂交（图5A、B）。将浓度0.02-1 nM的标记寡核苷酸与不同浓度未标记DNA混合平衡后，置于阱场环境中记录1-5分钟的逃逸时间。持续时间直方图显示两个主导时间尺度：短时组分（t1≈10 ms）对应游离标记寡核苷酸，长时组分（t2≈30 ms）对应与ssDNA结合的复合物（图5A）。通过双指数拟合确定两组分丰度，并绘制其与未标记结合伴侣浓度的关系曲线，最终获得相互作用的Kd值（图5B）。 2.实验观察到结合亲和力随寡核苷酸长度增加而系统性增强（表现为Kd值逐步降低），与既往研究高度吻合（图5D）。虽然样品需孵育数小时至数天以达到结合平衡，但图5B中单个数据点的t1,2测量仅需1-5分钟。该方法的快速响应特性还可用于实时监测结合动力学：既可在两种未结合组分混合后追踪结合过程，也能在已结合复合物中加入未标记"竞争剂"后观察解离过程（图5C下图）。通过分析丰度随时间变化曲线（类似图2B），可同步测定同一反应的解离速率（koff）与结合速率（kon）。实测速率所得的Kd（=koff/kon）与平衡测量结果及理论预测值均保持一致（图5C）。
DNA与酶亲和力分析 进一步研究了单标记DsDNA与未标记限制性内切酶的结合亲和力（图6A）。实验中向0.25 nM含酶切位点的荧光标记24-bp DNA中梯度加入EcoRI限制酶。对于结合后逃逸时间变化达2-5倍（Δtesc）的体系，其P(Δt)直方图可通过多指数拟合解析各组分丰度（图5A）。通过双时间尺度拟合获得的DNA结合分数显示Kd≈1.5 nM，与文献报道值（Kd≈1 nM）高度一致。
四、总结展望 逃逸时间立体测量技术（ETs）实现了三大突破：（1）提供分子三维结构的量化解析；（2）获取分子相互作用的热力学与动力学数据；（3）建立高速高灵敏的诊断检测平台，成功攻克了分子测量技术长期存在的整合难题。该技术特别擅长检测弱相互作用形成的多聚体复合物——这类结构用常规方法往往难以识别。通过实现溶液相构象图谱与分子模型的高通量匹配，ETs能为机器学习的三维结构预测、验证与推理提供关键支持。这种能力对研究无序蛋白质、RNA等复杂结构问题，以及探测和表征稀有分子状态具有特殊价值。
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发表于 2025-5-13 11:18:25
