电子衍射专题——XtaLAB Synergy-ED对纳米晶体的结构分析：3D ED/MicroED集成平台

轻舞飞扬

Rigaku Journal, 39(1), 2023，Pages06-09；技术文章
作者：伊藤昭夫*和山野明仁**，
摘要
       3D ED/microED因其能够对小于1μm的晶体进行结构分析而受到广泛关注。本文将介绍晶体结构分析的例子和MicroED/3D ED的一些应用。
1. 导言
       单晶X射线结构分析所需的最小晶体尺寸是多少？这个问题的答案取决于X射线源和探测器。最新的实验室系统能够确定1-10μm晶体的结构；然而，测量小于1μm的晶体仍然很困难。尽管进行了广泛的尝试，但结晶往往无法产生超过1μm的晶体，使结晶成为目前晶体结构分析的最大障碍。最近，使用电子束而不是X射线的单晶分析作为克服这一问题的方法引起了人们的广泛关注。自从几个小组在过去几年中开始积极发表论文以来，使用电子衍射的单晶分析已经被称为许多不同的名称——RED、cRED、EDT等。在本文中，我们将使用术语“3D ED/MicroED”，并将重点介绍3D ED/MioED的示例和应用。
2. 为什么是电子衍射？
       如上所述，电子束可用于确定小于1μm晶体的结构。这是因为电子束的散射截面比X射线的散射截面大10^5至10^6倍；因此，它与材料的相互作用强了几个数量级（1）。同时，与材料更强的相互作用也表明样品有可能很容易被电子束损坏。因此，直到最近，3D ED/MicroED仅限于相对耐电子束损伤的无机化合物，很少用于一般结构测定。然而，情况发生了巨大变化。探测器的技术创新使入射电子束的强度降低到损伤可以忽略不计的水平成为可能。配备HPC（混合光子计数）探测器的3D ED/MicroED系统可用于确定易受电子束损伤的样品的结构，如有机和蛋白质晶体（2）。由于现在几乎所有的晶体样品都可以进行3D ED/MicroED测量，因此这项于20世纪40年代至70年代首次开发的技术近年来再次引起了人们的极大关注。事实上，2018年，一篇关于3D ED/MicroED结构测定的论文被选为《科学》杂志的“年度突破”（3）。
       尽管对3D ED/MicroED的需求不断增加，但使用这种分析技术进行测量和分析并不简单。直到最近，电子衍射实验主要是作为通用透射电子显微镜的功能进行的。这些障碍高于X射线结构分析，因为它需要电子显微镜专家来确定衍射实验设备的最佳设置。为了解决这种情况，Rigaku理学集团和JEOL日本电子联合开发了一个专门用于3D ED/MicroED的电子衍射平台。该系统被称为XtaLAB Synergy-ED（以下简称Synergy-ED）。有了Synergy-ED，任何人都可以轻松地进行电子衍射实验（4）。
3. 结构确定和应用示例
3.1. 轮烷的结构测定
       到目前为止，作者已经使用Synergy-ED确定了320多种化合物的结构。大多数晶体都小于1μm。然而，即使晶体足够大，可以进行X射线衍射，3D ED/microED有时也是有效的。据观察，Synergy-ED仅能分辨3 Å的X射线衍射晶体的结构。
       作者与英国伯明翰大学和诺丁汉大学合作，使用Synergy-ED对轮烷（约3500 Da）进行了结构测定（5）。最初，他们试图在同步辐射上确定结构。然而，仅观察到1.25Å分辨率的差异，直接方法进行初始相测定很困难。对抗衡离子六氟磷酸盐进行建模是不可能的。因此，我们使用Synergy-ED对同步加速器实验中使用的同一批晶体进行了测量。结果，获得了1Å分辨率的数据，并通过直接方法成功确定了结构（图1）。差分傅里叶图清楚地显示了与六氟磷酸盐相对应的峰，并成功地将其纳入结构精修中。使用同步辐射进行单晶X射线结构分析非常重要，这是无可争议的。然而，轮烷的结构测定是一个很好的例子，说明3D ED/MicroED对衍射差的晶体比X射线衍射更有效。


图1 用Synergy-ED测定轮烷的结构。

3.2 片剂微晶结构分析
       晶体结构与片剂中活性成分的溶解度和洗脱等物理性质有关。由于市场上小分子药物的活性成分通常呈晶体形式，因此预计可以通过单晶结构分析来确定分子结构。然而，片剂中的晶体通常小于1μm，很难通过X射线衍射确定其结构。规避该问题的一种方法是使活性成分再结晶。然而，不能保证所获得的晶体结构代表片剂中存在的形式。在这种情况下，Synergy-ED成为一种强大的工具，因为它不需要重结晶，可以直接分析片剂中的晶体。作者对一种治疗过敏性鼻炎的非处方药进行了测量。我们首先轻轻粉碎药片，从药片中提取一些粉末。然后，我们使用Synergy-ED对细粉进行了测量和分析。在5分钟内成功确定了活性成分的结构。测量时间短是3D ED/MicroED的另一个优势。此外，还获得了被认为是添加剂的化合物的结构（图2）和可能属于结晶聚合物的衍射图案。


图2 药片中化合物的结构测定。将片剂粉碎（左上），并测量片剂中的细粉（中上和右）。被测晶体的厚度约为500nm。显示了活性成分（左下）和被认为是添加剂的化合物的结构（右下）。

       Synergy-ED的微晶测量使我们能够确定我们测试的几乎所有其他市售药物的活性成分的结构。Synergy-ED的结构测定过程比使用X射线的传统结构测定快得多。3D ED/microED也可以消除活性成分的再结晶。Synergy-ED预计将有助于加快小分子药物的整个研发过程。
3.3 定量分析
       由于3D ED/MicroED可以测量亚微米晶体，因此可以测量与粉末X射线衍射所用晶体一样小的晶体。此外，由于3D ED/MicroED的测量时间极短，因此可以通过顺序测量散布在网格上的数百个晶体来进行定量分析。此外，由于可以确定晶体结构，还可以捕获每个晶体的个体特征，如晶体堆积和晶格常数的差异。
       对乙酰氨基酚被广泛用作冠状病毒感染的解热镇痛药，已知有几种晶体多晶型（6）。在室温下，几乎所有的晶体都以I型存在。众所周知，通过加热、熔化和冷却进行再结晶会产生II型。此外，还确定了另外两种表格（表格III和表格IV）。对于定量分析，使用通过加热、熔化和冷却用XRD-DSC附着物重结晶的对乙酰氨基酚。使用“队列模式”进行测量，这是CrysAlisPro for ED的一个功能，也是Synergy-ED中集成的控制和分析软件。队列模式提供半自动测量，收集测量前提交的晶体列表的数据集。除了测量外，还可以使用CrysAlisPro for ED的脚本功能同时进行数据处理和结构确定。定量分析结果如图3所示。总共测量了200个晶体，并获得了100个晶体的结构。正如粉末X射线衍射结果所预期的那样，再结晶将I型粒子减少到10%。相比之下，发现晶型II和晶型III比晶型I更丰富。除了每种多晶型的比例外，每种结晶多晶型结构都是自动确定的（图4）。


图3 对乙酰氨基酚的定量分析结果。在200次测量中自动确定了100个结构。


图4 通过自动分析确定对乙酰氨基酚各晶型的结构。 显示了a轴投影中每种结晶多晶型的堆积。可以同时获得样品中多晶型物比例的信息和结构信息。

       这里，对药物进行了同时进行结构测定的定量分析。这种能力在材料科学等其他领域也可能有用。
3.4 绝对结构的确定
      确定光学活性化合物的绝对结构非常重要，因为每种构象对生物体都有不同的生物学影响。例如，L-亮氨酸是苦的，而D-亮氨酸是甜的。
在X射线晶体学中，绝对结构是通过利用弗里德尔对之间的差异来确定的；即i（h k1）≠i（h k2）。同时，在3D ED/MicroED中，Friedel定律不是被反常色散打破的，而是被多重散射打破的。据报道，可以利用这一现象确定绝对结构（7）。作为测试用例，作者试图使用Synergy-ED确定L-酪氨酸的绝对结构。绝对结构确定的流程如下：
( 1 )利用Synergy-ED采集衍射数据。
( 2 )使用CrysAlisPro for ED进行数据处理。CrysAlisPro for ED创建了一个衍射文件，用于考虑多重散射的动态精修。
( 3 )将衍射文件导入Jana2020 ( 8 )中进行动态精修。
( 4 )反转结构，重复精修。给出较低R1和wR2的对映异构体有望是具有正确绝对构型的对映异构体。
      对于酪氨酸的绝对结构测定，在L -酪氨酸和D -酪氨酸模型上进行了精修，并比较了R1和wR2。正确的构象L -酪氨酸比D -酪氨酸具有更低的R1和wR2值。如图5所示，L -酪氨酸确实给出了比D -酪氨酸更低的R1和wR2值。这一检查证实了3D ED / micro ED具有确定绝对结构的能力。3D ED / Micro ED可以用于测定晶体的绝对结构，这可能会导致小于1 μ m的晶体绝对结构测定增加。


图5 3D ED / Micro ED测定L -酪氨酸的绝对结构。数据收集和数据处理由Synergy-ED系统完成，结构精修由Jana2020完成。

      3D ED/MicroED的另一个优点是，它可以确定仅由碳和氢等轻元素组成的化合物的绝对结构。对于轻元素，X射线衍射的异常色散较小，有时很难确定有机分子的绝对结构。同时，在3D ED/MicroED中，Friedel定律并没有被反常散射打破，而是被多重散射打破。因此，预计3D ED/MicroED受化合物中原子类型的影响较小。为了验证这一点，尝试使用3D ED/MicroED对仅由碳和氢组成的5α-胆甾烷进行绝对结构测定。这种化合物的绝对结构可以通过X射线确定，但它需要10倍或更多的数据冗余和几个小时的数据收集。相比之下，使用3D ED/MicroED进行测量只需要2分钟。考虑多次散射的结构约束得出了与X射线衍射确定的结构相同的结论。


图6 3D ED/MicroED测定5α-胆甾烷的绝对结构。仅使用非氢原子和各向同性温度因子进行结构修复。

      有人说，单晶X射线结构分析是确定绝对结构的唯一方法。然而，已经证明3D ED/MicroED在绝对结构测定方面同样有用，如L-酪氨酸和5α-胆甾烷的例子所示。预计X射线衍射或3D ED/MicroED将根据晶体尺寸和化合物类型作为补充技术使用，或者两者同时用于验证目的。
4. 结论
     本文介绍了使用Synergy-ED通过3D ED/MicroED进行晶体结构分析，重点介绍了测量和应用实例。X射线晶体学的重要性是不可否认的。然而，在未来，单晶X射线结构分析和3D ED/MicroED的互补使用将变得越来越关键，具体取决于晶体尺寸、样品量和实验目的。
参考文献

(1) R. Henderson: The potential and limitations ofneutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstainedbiological molecules. Quar. Rev. Biophys., 28(2), 171–193(1995).

( 2 )    M.Gemmi, E. Mugnaioli, T.  E. Gorelik, U. Kolb, L.  Palatinus,

P. Boullay, S. Hovmöller, and J. P. Abrahams: 3D Electron Diffraction: TheNanocrystallography Revolution. ACS Cent.Sci., 28(8), 1315–1329 (2019).

( 3 ) R. F. Service: Molecular CT scan could speeddrug discovery,Science, 26, 362 (2018)

( 4 ) S. Ito, et al.: Structure determination of smallmolecule compounds by an electron diffractometer for 3D ED/MicroED. CrystEngComm. 23, 8622–8630 (2021).

( 5 ) N. Pearce, K. E. A. Reynolds, S. Kayal, et al.:Selective photoinduced charge separation in perylenediimide-pillar[5] arenerotaxanes. Nat. Commun., 13, 415 (2022).

( 6 )  A. G. Shtukenberg, M. Tan,  L.Vogt-Maranto, E. J. Chan, W.  Xu, J. Yang, M. E. Tuckerman, C. T. Hu,and B. Kahr: Cryst. Growth Des., 19(7), 4070–4080 (2019).

( 7 ) P. Brázda, L. Palatinus,and M. Babor: Electron diffraction determines molecular absoluteconfiguration in a pharmaceuticalnanocrystal. Science, 364(6441), 667–669 (2019).

( 8 ) V. Petříček, M. Dušek, and L. Palatinus:Crystallographic Computing System JANA2006: General features Zeitsch. für Kristallogr.-Cryst. Mater., 229(5), 345–352(2014).

本文译自ShoIto and Akihito Yamano,Rigaku Journal, 39(1), 2023

水平有限，有不当之处请各位坛友指正~

本想发在资源子版块文献分类，后来想想ED比较新的技术，还是发在讨论区供大家学习讨论比较好~

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搁浅

是一个新技术，还需要挺长时间发展的